摘要：本研究旨在应用CRISPR/Cas9技术高效构建Ace2 (angiotensin-converting enzyme 2)基因敲除小鼠模型,并繁殖、鉴定及验证Ace2基因敲除小鼠。通过构建靶向敲除Ace2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和向导RNA (guide RNA, gRNA)显微注射到小鼠受精卵中,通过PCR和TA克隆测序对小鼠Ace2基因的第3至18号外显子删除情况进行检测和鉴定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法验证获得的Ace2-/Y小鼠主要脏器中Ace2 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,顺利构建表达gRNA载体并体外转录,成功将有活性的gRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵,获得6只阳性F0代初建鼠,PCR和基因测序鉴定表明成功删除了小鼠Ace2基因的第3至18号外显子;F0代鼠与野生型鼠回交,得到3只阳性F1代鼠,再与野生型鼠相交配得到的后代为F2代,在F2代中选择Ace2-/+雌性杂合子鼠与野生型鼠交配,获得F3代Ace2-/Y雄性纯合子小鼠。qRTPCR和Western blot结果表明,F3代Ace2-/Y小鼠肾脏和肺中未检测到Ace2 mRNA和蛋白表达。本方法通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Ace2基因敲除小鼠模型,为进一步研究Ace2基因功能奠定了基础。
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