摘要：目的:通过构建和比较经Wnt5a基因修饰的巨噬细胞分别与骨髓干细胞(MSCs)2D单层贴壁与骨髓液跨小室共培养模型,旨在探索Wnt5a信号通过调控巨噬细胞炎症反应对MSCs成软骨分化产生的影响.方法:自2015年9月至2018年12月收集6例重度膝关节骨关节炎拟行全膝关节置换术者的巨噬细胞、MSCs和骨髓液,其中男2例,女4例;年龄58~71岁.膝关节囊滑膜组织常规消化取得单细胞,经反复贴壁并行Ficoll液密度梯度离心和抗CD14抗体流式细胞术测定巨噬细胞纯度.将上述经鉴定的巨噬细胞置于IFN-γ联合TNF-α刺激48 h后,再使用重组腺相关病毒(rAAV)-lacZ或Wnt5a转染24h,分别与MSCs 2D单层贴壁或骨髓液构建跨小室共培养模型,采用HE染色、软骨特殊染色、X-gal染色、抗Wnt5a、抗Ⅱ和Ⅹ型胶原免疫组化染色对细胞形态与增殖能力、病毒转粢效率和成软骨分化能力等进行检测.结果:抗CD68免疫组化显示骨关节炎患者滑膜组织巨噬细胞明显增多.抗CD14流式细胞术证实经分离的滑膜巨噬细胞纯度为90.31%,IFN-γ联合TNF-α刺激后发现上清液中单核细胞趋化素蛋白-1(MCP-1)水平明显升高,提示巨噬细胞被激活;rAAV-lacZ转染3d后,Ⅹ-gal染色发现其能有效转染巨噬细胞,效率高达97.50%,且至少持续21 d;rAAV-Wnt5a转染巨噬细胞后通过刺激其Wnt5a的表达,而增加两种模型中的Wnt5a表达,抑制MCP-1的分泌,两种模型中Wnt5a组MCP-1表达量分别为14.76和61.51 pg/ml;此外,rAAV-Wnt5a转染后能促进细胞增殖及成软骨分化、软骨基质合成.结论:在巨噬细胞与MSCs 2D单层贴壁或骨髓液跨小室共培养条件下,rAAV介导的Wnt5a过表达能通过影响巨噬细胞炎症反应而促进软骨稳态的维持以及MSCs成软骨分化,巨噬细胞可能通过Wnt5a信号影响软骨稳态与MSCs成软骨分化.
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